基因敲除小鼠助力浙大蔡哲钧/李飞课题组发现主动脉瓣钙化机制

近日，浙江大学蔡哲钧及华中科技大学李飞共同通讯在European Heart Journal（IF=30）发表研究论文（Endothelial cell-derived tetrahydrobiopterin prevents aortic valve calcification Get access Arrow），证明内皮依赖性BH4水平的降低促进了过氧亚硝酸盐的形成，最终导致主动脉瓣钙化；而饮食补充叶酸（FA）可通过挽救BH4的生物利用度来减轻高胆固醇血症引起的主动脉瓣钙化。该研究中Apoe−/−鼠、Gch1fl/fl鼠和Tie2-Cre鼠由集萃药康供应。

正文

钙化性主动脉瓣疾病（CAVD）是常见的心血管疾病，以主动脉瓣及其周围组织纤维化、硬化、钙盐沉积为主要改变，主动脉瓣狭窄为主要功能损害。主动脉瓣由瓣膜间质细胞（VIC）和瓣膜内皮细胞（VEC）组成。瓣膜内皮细胞衍生的一氧化氮（NO）是瓣膜钙化早期阶段的天然抑制剂，也是瓣膜稳态和病理的重要调节剂。研究表明，eNOS功能障碍在主动脉瓣钙化的发展中起着至关重要的作用。四氢生物蝶呤（BH4）是eNOS生物学功能的关键决定因素，BH4不足可引起内皮一氧化氮合酶功能障碍，导致内皮功能障碍并引发血管疾病。但BH4在主动脉瓣钙化中的作用尚未明确。

本研究探索VEC衍生的BH4在主动脉瓣钙化中的作用机制，发现BH4水平降低会导致VEC产生过氧亚硝酸盐（ONOO-），促进VIC中Y628动力蛋白1的酪氨酸硝化，随后导致VIC成骨分化和瓣膜钙化。

研究结果

钙化性主动脉瓣疾病患者血浆和主动脉瓣中BH4水平、BH4:BH2比值、GCH1和DHFR表达降低，而过氧亚硝酸盐生成增加。与正常主动脉瓣相比，钙化主动脉瓣中BH4生物合成的两种关键酶，鸟苷5'-三磷酸环水解酶I（GCH1）和二氢叶酸还原酶（DHFR）显著减少。

图1 CAVD患者的BH4生物合成减少

动物实验证明内皮细胞特异性GCH1缺乏促进主动脉瓣钙化，并诱导的内皮细胞活化和主动脉瓣的纤维化重塑，增加了主动脉瓣中过氧亚硝酸盐的形成。24周西方饮食作用后，与Apoe−/−Gch1fl/fl小鼠相比，Apoe−/−中Gch1的内皮细胞特异性缺陷小鼠（Apoe−/−Gch1fl/flTie2 Cre）的主动脉瓣叶中的跨瓣峰值射流速度、钙沉积、Runx2、dihydroethidium (DHE) 和3-硝基酪氨酸（3-NT）水平明显升高。

图2 内皮细胞特异性Gch1缺乏促进体内主动脉瓣钙化

过氧亚硝酸盐通过Y628动力蛋白1硝化促进VEC衍生的BH4减少而诱导的VIC成骨分化。氧化的LDL (ox-LDL) 与si-GCH1或 si-DHFR 转染的VEC共培养诱导瓣膜间质细胞 (VIC) 的成骨细胞分化，而补充BH4可以消除这种影响。VECs中BH4的缺乏导致VICs在ox-LDL 刺激下过氧亚硝酸盐形成增加和3-NT蛋白增加。

图3 VEC衍生的BH4可防止VIC成骨分化

图4 过氧亚硝酸盐有助于VEC衍生的四氢生物蝶呤还原诱导VIC成骨分化

图5 过氧亚硝酸盐通过Y628动力蛋白1硝化促进VIC成骨分化

叶酸通过VEC中DHFR抑制VIC成骨分化，并挽救四氢生物蝶呤减轻高胆固醇血症引起的主动脉瓣钙化，抑制主动脉瓣的内皮活化和纤维化重塑。

图6 叶酸通过VEC中的DHFR抑制VIC成骨分化

图7 叶酸减轻西方饮食喂养的Apoe-/-小鼠的主动脉瓣钙化

结论

随着人口老龄化，钙化性主动脉瓣疾病（CAVD）的发病率在我国呈逐年上升趋势，已成为老年人常见心脏瓣膜病。CAVD以往被视为是一种与瓣膜退行性变、钙盐沉积相关的被动过程，最新研究表明，CAVD的发生可能涉及内皮损伤、脂质浸润、慢性炎症、基质重塑、细胞分化、进展性钙化等复杂变化的主动过程。本研究发现内皮依赖性BH4水平的降低促进了过氧亚硝酸盐的形成，随后导致DRP1酪氨酸硝化和 VIC的成骨细胞分化，从而导致主动脉瓣钙化。因此，在饮食中补充FA可能会减轻高胆固醇血症引起的主动脉瓣钙化。

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